Genotipul

Genotipul reprezintă totalitatea materialului genetic al unui organism. De multe ori se face confuzie între termenii genotip și genom. Spre deosebire de genom care este definit ca fiind totalitatea materialului genetic codat în macromoleculele de ADN ale celulei sau organismului, genotipul se referă în mod specific la o anumită trăsătură condiționată de materialul genetic al unui cuplu alelic. Genotipul reprezintă informația genetică pură, neinfluențată ambiental a unui cuplu alelic. El determină un caracter genetic pur. Contactul dintre factorii de mediu și genotip va duce la stabilirea formei finale în care se va exprima caracterul pentru individul respectiv, combinația dintre genotip și factorii de mediu conducând la formarea caracterelor fenotipice, observabile ale unui individ.

Materialul genetic

În nucleul celulei eucariote se află stocat materialul genetic responsabil de sinteza proteică și de transmiterea ereditară a trăsăturilor în lumea vie. Materialul ereditar are ca formă de organizare la nivelul nucleului cromatina.
Cromatina este forma sub care cromozomii apar evidenți în interfază. Aceștia pot fi vizualizați la microscopul optic doar în timpul diviziunii celulare, iar interfaza este etapa ciclului celular în care cromozomii se colorează cel mai bine cu colorațiile specifice de bandare.
Structura cromozomilor umani, atât a celor autozomali cât și a celor gonozomali este extrem de complexă. Ei sunt alcătuiți din gene, iar fiecare genă ocupă un loc specific în cadrul cromozomului, numit locus. Proporțiile sub care se prezintă componentele cromzomiale sunt următoarele: 13-15% ADN, 12-12% ARN cromozomial, 68- 72% proteine histonice și nonhistonice, pe lângă acestea mai aflându-se și cantități mici de lipide, ioni de calciu și magneziu.
ADN-ul este evident cea mai importantă componentă a cromozomului, întrucât fără existența acestei macromolelcule sinteza proteinelor, ereditatea și expresia caracterelor genetice la indivizi ar fi fost imposible. Fără existența acizilor nucleici, și a ADN-ului în particular, viața pe Terra nu ar fi fost posibilă.
ADN-ul cromozomial este împărțit în mai multe fracțiuni, în funcție de modul în care se repetă secvențele nucleotidice. Astfel, există ADN-ul repetitiv care este în general non-informațional, întrucât nu conține gene structurale ci îndeplinește roluri în ce privește reglajul genetic, diferențierea celulară și evoluția materialului genetic. Un alt tip de ADN este ADN-ul nerepetitiv, care conține secvențe unice de nulceotide, cu activitate transcripțională, responsabile de sinteza ARN mesager pe matriță ADN, ARN care va începe procesul de translație sau biosinteză a proteinelor care are loc intraribozomal.

Cromatina

Cromatina sau forma sub care se organizează materalul genetic în nucleul celular eucariot se pezintă sub forma a două stări funcționale alternative și reversibile, în funcție de modul în care se vizualizează la microscopul optic după ce a fost colorată specific cu Giemsa.
Eucromatina conține secvențele nerepetitive sau unice de ADN responsabile de codificarea materialului genetic al celulei respective. Pe cromzomii interfazici se vizualizează ca fiind slab colorată. Ea se condensează în timpul diviziunii și se decondensează în interfază. Este partea activă genetic a cromatinei deoarece la nivelul ei se află cea mai mare parte din proteinele non-histonice care condiționează funcționalitatea materialului ereditar în procesele de replicare și transcriere.
Heterocromatina este condensată în interfază, apărând sub formă de cromocentri. Din acest motiv absoarbe bine colorantul și se evidențiază mult mai puternic la microscopie optică pe cromozomii interfazici decât eucromatina. Ea este forma inactivă a cromatinei, neavând rol în transcriere, deoarece replicarea ADN este întârziată la nivelul ei.
Euromatina conține genele majore care conțin material genetic activ în replicare, transcripție și translație, pe când heterocromatina conține mai degrabâ secvențe genice reglatoare, având și funcție structurală.

Structura cromatinei

Unitățile structurale ale cromatinei eucariote sunt nucleozomii, care formează lanțul flexibil de cromatină nucleară. Fiecare nucleozom se prezintă sub forma unui cilindru turtit, format dintr-un octamer de proteine histonice (H2A, H2B, H3 și H4 luate câte două) , octamer care este înconjurat la exterior de un segment ADN alcătuit din 140 de perechi de nucleotide îlănțuite secvențial. Aceste nucleotide formează o pereche de inele la vârful cilindrului și una la baza cilindrului octameric. Legătura dintre doi nucleozomi dispuși în lanț se realizează cu ajutorul unei secvențe de câteva zeci de nucleotide care sunt unite cu histone de tip H1, un alt tip de histone, care nu intră în structura octamerului care formează structura primară a nucleozomului.
Uniunea dintre ADN și histone se numește complex nucleohistonic care alcătuiește fibra de cromatină, diametrul mediu al fibrelor de cromatină din nucleul celular variind între 100 și 300 de Angstromi.
Fiecărui cromozom uman îi corespunde o singură fibră de cromatină nucleohistonică, deci o singură macromoleculă dublu catenară de ADN. Nucleul conține însă și proteine non-histonice care sunt foarte heterogene, prezentând specificitate de specie și de țesut. Ele sunt activatorii specifici ai genelor eucariote, prin fosforilarea non- histonelor crescând rata de transcriere.
Celula pregătită pentru diviziune își dublează atât cantitatea de ADN, cât și cantitatea de cromatină. La începutul mitozei sau meiozei fiecare cromozom este dublu, iar o celulă diploidă este înainte de a se diviza, tetraploidă având o cantitate dublă de cromatină. Înaintea diviziunii fiecare cromozom este format din două cromatide care sunt subțiri, filamentoase și identice din punct de vedere informațional. Sunt unite prin centromer și reprezintă de fapt cromozomii-fii care nu s-au despărțit încă.
Cromozomii devin vizibili la începutul profazei deoarece se îngroașă, se scurtează și se spiralizează, ceea ce îi face evidenți la microscopul optic datorită creșterii gradului de condensare a cromatinei care îi formează. În metafază, condensarea cromozomilor este maximă, această etapă fiind folosită pentru analiza optică a eucromatinei și heterocromatinei precum și pentru bandarea cromozomilor. Cromozomii pot fi fotografiați la mcicroscop în momentul în care se dispersează din planul ecuatorial al celulei odată cu ruperea fibrelor fusului de diviziune. Apoi, imaginile obținute se decupează și perechile de cromozomi se ordonează în perechi numerotate în ordinea descrescătoare a mărimii, obținându-se astfel cariotipul speciei respective. Ei sunt clasificați și în funcție de poziția centromerului care unește cele două cromatide, fiind diferențiați astfel cromozomi metacentric, submetacentrici, subtelocentrici și acrocentrici.

Reglajul genetic

Mecanismele de reglaj genetic ale celulei eucariote sunt foarte complexe, existând două mecanisme de reglaj:
1. Reglajul genetic pe termen scurt, care determină variații în concetrația și activitatea intracelulară a enzimelor, hormonilor, proteinelor și acizilor nucleici ADN și ARN
2. Reglajul genetic pe termen lung care implică fenomenele de diferențiere celulară în cadrul cărora celula se specializează și dobândește diferite funcții în funcție de țesutul din care va face parte, reglaj cu rol esențial în creșterea și dezvoltarea organismului pornind de la celula ou sau zigot până la individul matur

Reglajul genetic pe termen scurt

Se realizează la nivel transcripțional, întrucât fiecare genă este transcrisă individual de către ARN mesager care poartă mesajul genetic al unei singure catene polipeptidice de ARN. Reglarea genetică a sintezei proteice este extrem de complexă, realizându-se pe 5 niveluri diferite:
1. Nivelul transcrierii genice: este nivelul cel mai important. În cadrul lui se selectează precis genele care vor fi transcrise apoi are loc sinteza de ARN mesager precursor pe catena matriță de ADN. ARNm precursor conține atât secvențe informaționale sau exoni, cât și secvențe non-informaționale sau introni iar controlul la acest nivel se realizează cu ajutorul unor proteine activatoare care asigură succesiunea corectă a procesului de transcripție a genelor din ADN pe ARN mesager precursor.
2. Nivelul prelucrărilor post-transcripționale în cadrul căruia are loc secționarea moleculei de ARNm precursor cu separarea secvențelor informaționale (exonilor) care rămân în structura acestuia de introni (secvențele non informaționale). Alte enzime sunt responsabile de legarea exonilor între ei cu formarea ARN mesager matur.
3. Nivelul membranar presupune selecția moleculelor de ARNm matur care vor trece din nucleu în citoplasmă, trecerea făcându-se prin porii membranei nucleare
4. Nivelul translației. Aici se selectează ARNm care va fi utilizat ca mesager de către ribozomi pentru sinteza catenelor polipeptidice la nivel ribozomal
5. Nivelul prelucrărilor posttranslaționale este etapa în care sunt selectate moleculele de ARNm matur din citoplasmă care nu au fost utilizate în biosinteza proteică și vor fi degradate.
Reglajul genetic pe termen scurt poate fi influențat de proteinele histonice și non-histonice, de modul în care sunt dispuse benzile de heterocromatină în structura cromozomilor, de acțiunea unor hormoni și de metilarea și acetilarea bazelor azotate și proteinelor histonice.

Reglajul determinat de histone și non-histone

Cel mai important rol îl au proteinele histonice și non-histonice care formează complexe cu ADN-ul din nucleul celulei eucariote. Histonele funcționează ca niște represori generali ai tuturor genelor, iar proteinele non-histonice hotărăsc care dintre gene intră în procesul de transcripție. Astfel, fiecare proteină non-histonică este capabilă să recunoască o secvență specifică de nucleotide din molecula de ADN, secvență pe care histonele o represează.
După ce non-histona a recunoscut secvența genică ce va intra în transcripție ea se fosforilează și devine mult mai încărcată negativ decât segmentul de ADN cu care este cuplată. Datorită electronegativității, proteina histonică va fi mai mult atrasă de proteina non-histonică decât de segmentul de ADN ales să intre în transcripție de către non-histonă. Prin urmare se formează un complex histonă- non-histonă care se desprinde de fragmentul ADN, iar ADN-ul rămas acum liber poate intra în procesul de transcripție. După transcripție și formarea ARN mesager precursor are loc defosforilarea non-histonelor cu desprinderea lor din complexul histonă-non-histonă și reasocierea lor cu ADN. Astfel, histona este liberă și au din nou acțiune represivă asupra genei.

Reglajul determinat de heterocromatina cromozomială

Heterocromatina este cromatina condensată din nucleul interfazic. Cromatina nu este funcțională și activă din punct de vedere genetic în stare condensată, astfel că, atâta timp cât cromatina există sub această formă, nu au loc nici replicarea nici transcripția genetică. Heterocromatinizarea unuia dintre cei doi cromozomi X la femeie este unul dintre mecanismele de reglare a activității genice la eucariote, astfel încât apare cromatina sexuală, sau corpusculul Barr inactiv în nucleii interfazici ai celulelor. Prin urmare, atât la bărbat cât și la femeie sunt active numai genele situate pe un singur cromozom sexual.

Metilarea și acetilarea bazelor azotate

Odată ce citozina dintr-o secvență de baze azotate este metilată, acea secvență genică este inactivă întrucât nu mai poate fi transcrisă. Inactivarea genelor este un proces asociat cu metilarea citozinei.
Acetilarea este procesul prin care o histonă își capătă încărcătura negativă suficientă pentru a se elibera de ADN pentru a da libertate transcrierii. Deci acetilarea histonelor este un mecanism de activare a genelor.

Reglajul genetic prin hormoni

Hormonii au capacitatea de a acționa asupra unor receptori moleculari situați la nivelul membranei celulare. Astfel, se generează un mesaj biochimic cu efect fie asupra unor gene, fie asupra unor sisteme enzimatice. Hormonii pătrund în celule țintă specifice și condiționează activarea și funcționarea anumitor gene, declanșându-se astfel cascade de reacții chimice și metabolice datorită activării în serie a transcripției genelor respective. De exemplu, hormonul numit prolactină activează la nivelul glandelor mamare genele care codifică sinteza proteinelor specifice din laptele matern.

Transpozonii

Sunt secvențe de ADN care au proprietatea de a exista pentru o anumită perioadă într-un anumit situs pe același cromozom sau pe cromozomi diferiți. Ei pot fi transcriși în ARN, secvența de ARN transcrisă cu ajutorul transpozonilor servin dca matriță pentru sinteza de ADN. Procesul se numește revers-transcripție și se realizează cu ajutorul unor enzime numite reverstranscriptaze, iar seccvențele ADN obținute în acest mod se numesc retrotranspozoni. Ei pot suprima activitatea unei gene sau pot produce mutații genetice.

Reglajul genetic pe termen lung

Se face prin citodiferențiere , sau diferențiere celulară, proces la finalul căruia fiecare celulă va avea o funcție specifică în organism. Pornește de la celula ou, sau zigot care intră în diviziuni mitotice succesive iar din celulele rezultate va lua naștere embrionul. În cadrul embrionului are loc procesul de diferențiere primară, care reprezintă împărțirea acestuia în trei straturi celulare pe baza diferențierii grosiere ale celulelor în ectoderm, mezoderm și endoderm. Apoi are loc diferențierea fină sau diferențierea propriu-zisă prin:
- încetarea totală a diviziunii celulare în cazul neuronilor
- ritm normal de diviziune celulară în cazul țesutului hematopoietic (din care se formează elementele figurate sanvine: leucocite, eritrocite, trombocite)
- instalarea unui ritm lent de dezvoltare: celule musculare, celule hepatice
- moartea celulară programată genetic sau apoptoza.
Reglajul genetic al diferențierii celulare constă în variația cantității de ADN din celulele organismului de-a lungul creșterii și dezvoltării acestuia precum și reglarea transcripției și biosintezei proteice.
Reglarea transcripției și translației (biosintezei proteice) se face prin activarea sau represia genelor într-o anumită ordine cronologică conform programului genetic stabilit de nucleu de-a lungul proceselor de diferențiere celulară. Aceste procese de reglare sunt efecte ale interacțiunii nucleu-citoplasmă și celulă-mediu.
Diferențierile celulare sunt condiționate de modul în care ARN-ul și proteinele din citoplasma zigotului sunt distribuite în celulele rezultate prin diviziune mitotică.
În celula eucariotă există de asemenea gene homeotice, care determină ca fiecare celulă a organismului să își execcute corect funcția ocupată în embrion și să se diferențieze normal. Între celulele vecine circulă mesaje chimice care fac ca o celulă aflată într-o anumită poziție față de celelalte să-și activeze programul genetic potrivit și să se specializeze în direcția potrivită. De asemenea, pe baza acestor mesaje celulele se pot activa sau inactiva reciproc.

Studiul materialului genetic

Studierea genomului uman precum și a genelor și modului în care acestea lucrează și se transmit de la o generație la alta este o știință de mare viitor și cu mare aplicabilitate practică. Tehnicile de studiu sunt foarte complexe și dificile, genotiparea, tehnologia ADN-ului recombinat și reacția de polimerizare în lanț fiind doar trei dintre ele.
Cea mai importantă, cea mai utilizată și cu cea mai mare aplicabilitate practică este fără îndoială reacția de polimerizare în lanț sau Polymerase Chain Reaction prescurtat PCR. Astfel, cu ajutorul PCR putem realiza:
Amplificarea ADN
Atunci când materialul ADN obținut de la un individ sau de la o celulă este puternic degradat dar trebuie utilizat totuși pentru studii de antropologie moleculară (studierea fosilelor, mumiilor sau țesuturilor formolizate) vom putea amplifica secvențele de ADN necesare analizei cu ajutorul PCR.
Pentru reacție sunt necesare:
- ADN-polimerază rezistentă la temperaturi înalte, care este extrasă dintr-o bacterie care trăiește în ape termale numită Thermus Aquaticus
- Matrița ADN de la țesutul pe care dorim să-l studiem, matriță pe care o vom amplifica prin PCR
- Primerii, reprezentați de două oligonucleotide sintetizate in vitro și alcătuite din lanțuri monocatenare foarte scurte. Ele vor forma hibrizi moleculari la capetele moleculei de ADN care urmează să fie amplificat. La aceste capete se va iniția activitatea ADN-polimerazei.

În reactor se introduc: proba de ADN, cele patru nucleotide ADN-trifosforilate, cei doi primeri și ADN polimeraza.
Amestecul se încălzește până când are loc denaturarea probei ADN. La temperaturi peste 100 grade Celsius are loc ruperea legăturilor slabe de hidrogen și rezultă ADN monocatenar. Amestecul de ADN se răcește apoi, ADN rămânând denaturat. Primerii se vor atașa, formând hibrizii moleculari la capetele cele două catene separate. ADN-polimeraza acționează și are loc sinteza ADN pe baza folosirii fiecărei catene de ADN denaturat ca matriță. Cantitatea de ADN se dublează prin acest proces iar operația se repetă, cu dublarea cantității de ADN la fiecare ciclu încălzire-răcire. Aparatele fac acest lucru automat.

Identificarea ADN

Pentru aceasta sunt necesare enzime de restricție. Ele taie molecula de ADN în fragmente de diferite dimenisuni. Baza identificării ADN este faptul că ADN uman conține porțiuni noninformaționale foarte variabile și diferite de la o persoană la alta. Prin urmare ADN de origini diferite va fi fragmentat în fragmente de restricție de lungimi diferite pe baza enzimelor care acționează la nivelul porțiunilor noninformaționale din ADN.
Amestecul de fragmente de restricție este plasat apoi pe opeliculă de gel așezată în câmp electric. Datorită grupărilor fosfat încărcate negativ din ADN, fragmentele migrează prin gel spre anod, fragmentele cele mai mici migrând mai repede și mai departe iar fragmentele mari cu viteză mai mică și parcurgând o distanță mai scurtă. Astfel pe pelicula de gel se va forma o succesiune de benzi care vor fi puse în evidență cu ajutorul unor coloranți specifici pentru ADN cum ar fi bromura de etidiu. Configurația benzilor diferă de la o persoană la alta și constituie amprenta ADN a persoanei respective. Este identică la gemeni și asemănătoare la rudele apropiate servind la identificarea persoanelor în criminalistică și medicina jurdiciară.

Sondele genetice

Cu ajutorul sondelor genetice poate fi determinată succesiunea nucleotidelor din ADN. Aceste sunde sunt reprezentate de fragmente monocatenare de ADN sau ARN a căror succesiune de nucleotide este cunoscută. Nucleotidele acestor fragmente vor fi marcate chimic sau radioactiv.
Sonda genetică se aplică peste un filtru care a absorbit ADN-ul denaturat din benzile separate prin electroforeză. Operațiunea se face la întuneric, peste filtru adăugându-se un film fotografic. Dacă ADN-ul cercetat conține secvența de nucleotide complementară sondei genetice se formează un hibrid molecular la nivelul uneia din benzi iar pe radiografie va apărea o linie în dreptul benzii respective. Se determină astfel dacă ADN-ul cercetat conține sau nu o anumită secvență nucleotidică, fapt foarte util în diagnosticarea mutațiilor, infecțiilor virale incipiente și cancerului în stadiu incipient. Devine posibilă și stabilirea locusului specific al diferitelor gene în cromozomi. Acest proces se mai numește și genotipare.