Testul de paternitate

Testul de paternitate este un test genetic care stabilește dacă un individ este sau nu tatăl biologic al unui copil. Dovada genetică a paternității are mare utilitate, mai ales în medicina legală. Există și teste de stabilire a maternității, mult mai rar folosite, fiind solicitate mai ales în cazuri de abandon în maternitate, pruncucidere sau adopții. În trecut s-au folosit diverse metode pentru stabilirea paternității, precum analiza antigenelor de grup sangvin, analiza antigenelor HLA, analiza antigenelor leucocitare sau analiza diferitelor proteine și enzime, însă toate acestea nu ofereau rezultate sigure.

Definiție test de paternitate

Testul de paternitate reprezintă analiza de laborator a 16 secvențe de ADN situate pe diferiți cromozomi, pentru a se stabili certitudinea faptului că un individ este tatăl biologic al copilului. Sunt necesare probe biologice de la presupusul tată și de la copil, analizându-se câte 16 markeri sau secvențe ADN de la fiecare, analiza ADN-ului fiind singura care conferă certitudine în determinarea gradului de rudenie. Se compară probele obținute de la cei doi indivizi analizându-se fiecare marker în parte și stabilindu-se complementaritatea dintre markerii de la copil și markerii de la tată. Dacă se recoltează probe și de la mamă, gradul de specificitate al testului va crește, însă acest lucru nu este neapărat necesar, testul având specificitate de 99, 9 % și în cazul recoltării a două probe, una de la prezumtivul tată și una de la copil. Testul se poate face atât prenatal cât și postnatal.

În România, costurile unui test de paternitate sunt cuprinse între 750 (se testează mama, prezumtivul tată și 1 copil) și 1.500 RON (se testează mama, doi tați prezumtivi și doi copii), în funcție de metoda de testare, proba biologică recoltată și numărul de probe analizate.
Rezultatul este disponibil în 3 - 7 zile lucrătoare de la trimiterea testelor la laborator, însă poate dura și mai mult, în funcție de tehnica folosită de laboratorul care execută analiza.

Se poate de asemenea determina fratria (legătura de rudenie dintre 2 sau mai mulți copii) și determinarea gradului de rudenie dintre copil și diverse persoane din familie (mătuși, unchi, bunici). De asemenea se poate stabili profilul ADN al individului, atât profilul ADN nuclear cât și ADN mitocondrial precum și testarea cromozomului Y pentru stabilirea legăturii de rudenie între persoanele de sex masculin (rudenia pe linie paternă).
Testarea zigozității gemelare se face folosind aceleași metode ca testul de paternitate și poate stabili dacă gemenii sunt monozigoți (identici) sau dizigoți.

Testarea prenatală

Există mai multe metode de recoltare a probelor biologice de la făt, necesare analizei ADN:

1. Amniocenteza.

Testul se face în trimestrul 2 de sarcină, începând cu săptămânile 16-20 prin recoltarea unei cantități mici, de 1,5 - 2 ml de lichid amniotic sub ghidaj ecografic, cu ajutorul unui ac lung și subțire. Riscul de afectare a fătului și avort spontan este minim. Ca efecte secundare pot apărea contracții, scurgere de lichid aminotic și sângerări vaginale. Pentru efectuarea acestei analize este necesar avizul unui ginecolog.

2. Biopsia de vilozități coriale.

Permite testarea timpurie, începând cu săptămânile 10-13 de sarcină. Presupune recoltarea unei porțiuni mici din placentă de la nivelul uterului. Este o procedură invazivă care se poate efectua transcervical (abord de la nivelul vaginului, trecând prin colul uterin până se ajunge la uter) sau transabdominal folosind un ac fin și subțire, sub ghidaj ecografic. Vilozitățile coriale reprezintă excrescențe tisulare fine, în deget de mănușă ce proemină pe peretele uterin. Au material genetic identic cu materialul genetic al fătului. Complicațiile sunt reprezentate de sângerarea transvaginală post-procedură și ruptura membranelor placentare. Pentru test este necesară recoltarea a 2-3 mm de țesut.

Atât amniocenteza cât și biopsia de vilozități coriale sunt teste de rutină care se fac prenatal nu numai pentru stabilirea paternității ci și pentru determinarea anomaliilor de material genetic și stabilirea diagnosticulul bolilor genetice și anomaliilor cromozomiale, diagnostic în urma căruia se poate opta pentru întreruperea sarcinii (avort terapeutic) . Biopsia de vilozități coriale prezintă avantaj în acest sens, deoarece poate fi efectuată mai repede, începând cu săptămâna 13 de sarcină. Recoltarea, atât în cazul amniocentezei cât și în cazul biopsiei de vilozități coriale se va face numai de către medicul ginecolog și numai sub ghidaj ecografic.

3. SNP microarray (single nucleotid polymorphism microarray)

este o tehnologie non-invazivă de determinare a paternității prin analiza ADN-ului fetal circulant, extras din sângele matern. Testul poate fi efectuat începând cu săptămâna 10 de sarcină. Se analizează ADN-ul fetal, ADN-ul mamei și ADN-ul de la prezumtivul tată. Se analizează 317.000 de markeri genetici reprezentați de nucleotide și în funcție de complementaritatea lor se stabilește paternitatea. Precizia acestui test este de 99,9% și el tinde să înlocuiască testele invazive precum amniocenteza și biopsia de vilozități coriale.

Testarea postnatală

Pentru testarea postnatală se pot recolta mai multe tipuri de probe biologice, nu doar sânge periferic, în cazul recoltării corecte și a unei cantități suficiente de probă precizia fiind aceeași ca în cazul utilizării sângelui periferic. Astfel, produsele biologice din care se poate face analiza ADN pentru stabilirea paternității postnatal includ:

- Sânge periferic, în cantitate de maximul 2 ml, recoltat prin puncție venoasă în vacuteiner cu EDTA (acid etilen-diamino-tetraacetic care acționează ca anticoagulant).
- Celule epiteliale bucale, recoltate cu ajutorul unui bețișor de plastic steril cu un capișon de bumbac la capăt care se introduce în cavitatea bucală raclându-se celulele epiteliale de pe fața internă a obrazului. Bețișorul se introduce apoi într-un recipient steril.
- 7-10 fire de păr cu rădăcină- se recoltează prin smulgere, nu prin tăiere deoarece pentru analiză se folosește rădăcina (bulbul) firului de păr. Se introduc într-un recipient steril.
- 2-3 mucuri de țigară care se depozitează într-un recipient steril cu obligația de a nu se contamina zona care vine în contact cu buzele individului. Astfel se va analiza ADN-ul din urmele de salivă lăsate pe mucul de țigară.
- Guma de mestecat depozitată într-un recipient steril, este luatăcu o pensetă, fără a fi atinsă. Testarea ADN se face tot din salivă.
- Unghii proaspăt tăiate și cuticule plasate într-un plic de hâtie steril sau recipient steril de plastic.
- Pete de sânge de pe materiale textile, evitându-se, ca și în cazurile de mai sus atingerea directă a probei.

Probele obligatorii pentru ca analiza să fie efectuată sunt cele recoltate de la copil și de la tatăl prezumtiv. Nu este obligatorie testarea unei probe de la mamă, însă prezența acesteia crește certitudinea rezultatului și probabilitatea confirmării paternității.

Metode de testare

Se folosește analiza probelor de ADN de la copil și de la prezumtivul tată, iar dacă aceste două probe sunt identice (ADN-ul de la copil este similar cu ADN-ul prezumtivului tată), șansa ca individul să fie tatăl biologic al copilului este de 99,9%. Dacă probele nu se potrivesc, atunci siguranța că individul nu este tatăl biologic al copilului este 100%. Există două metode de analiză a ADN-ului extras din probele biologice recoltate:
1. Polymerase Chain Reaction (PCR) sau reacția de polimerizare în lanț
2. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

1. Reacția de polimerizare în lanț

Este cel mai frecvent folosită pentru testele de paternitate. ADN-ul este izolat din probele recoltate. Se analizează câte 16 secvențe de ADN de la mamă, prezumtivul tată și copil, secvențele fiind denumite markeri STR (Short Tandem Repeats) care sunt localizate pe diverși loci cromozomiali într-o succesiune specifică fiecărui individ. Se va face astfel profilul genetic al fiecăruia dintre cei 3 indivizi analizați pe baza locilor cromozomiali în care se găsește fiecare secvență de ADN (marker STR) analizată.
Tehnica se bazează pe faptul că în timpul concepției cariotipul cromozomial al copilului se formează prin moștenirea unui cromozom de la mamă și unuia de la tată, până la totalizarea celor 46 de cromozomi ai celulei ou. Testul se realizează prin compararea locilor pe care îi ocupă fiecare secvență de ADN la copil cu locii de la mamă și locii de la tată, fiecare locus fiind notat cu un număr. De exemplu dacă mama are locii (1, 2) iar tata are locii (3, 4) copilul, prin moștenirea unui cromozom de la mamă și a unui cromozom de la tată trebuie să aibă fie locii (1, 3) fie (1, 4) fie (2, 3) fie (2, 4). Acest lucru se face pentru determinarea locusului fiecăreia dintre cele 16 secvențe de ADN și stabilirea corespondenței locilor secvenței respective de la copil cu secvența de la mamă și de la tatăl prezumtiv. Dacă localizările coincid, tatăl prezumtiv este tatăl biologic al copilului. În funcție de cât de bine se potrivesc secvențele se stabilește un index de paternitate. Dacă o secvență nu se potrivește indexul de paternitate pentru acel locus este 0. Când există nepotriviri între 3 sau mai multe secvențe se poate afirma cu certitudine că individul testat nu este tatăl biologic al copilului.

Tehnica PCR
Este metoda prin care o secvență de ADN este amplificată in vitro. ADN-ul natural suferă procesul de replicare sau de sinteză, prin care o secvență nouă de ADN este sintetizată folosind o secvență de ADN mamă, numită matriță. PCR realizează replicarea ADN în laborator. Astfel se obțin cantități mai mari dintr-o anumită secvență de ADN, care pot fi apoi analizate. Pentru reacție sunt necesare:
- probele de ADN ce vor fi analizate (de la prezumtivul tată, de la mamă și de la copil), acestea urmând a fi aplificate (se numesc ADN matriță)
- o ADN polimerază
- primeri (oligonucleotide)
- tamponul de reacție
- ioni de Magneziu

Reacția presupune denaturarea termică a matriței ADN cu desfacerea dublului helix, atașarea primerilor și polimerizarea. La terminarea primului ciclu de polimerizare (amplificare) se obține o cantitate dublă de ADN față de cantitatea ADN matriță. Se realizează între 25 și 40 de cicluri de amplificare. Cantitatea de ADN matriță minimă pentru succesul reacției este 500 nanograme de ADN nuclear. Primerii folosiți sunt artificiali și trebuie să fie complementari cu capetele 5’ și 3’ ale regiunii de ADN care urmează să fie amplificată. ADN polimeraza folosită pentru reactive este obținută din microorganisme termofile și trebuie să fie termostabilă pentru a rezista la temperaturile la care se practică reacția de polimerizare în lanț (100 grade celsius). Cel mai frecvent se folosește ADN polimeraza Taq, sau Taq Pol, obținută din microorganismul Termus Aquaticus. Taq Pol rezistă la toate cele trei trepte de temperatură la care se realizează PCR și anume: 90 - 95 grade Celsius pentru denaturarea ADN matriță și desfacerea dublului helix, 55 - 60 grade pentru atașarea primerilor la fiecare dintre cele două catene ale ADN matriță denaturat și 72-75 grade pentru reacția de polimerizare.

Etapele reacției de polimerizare în lanț:
a. Denaturarea ADN-ului dublu catenar
Se realizează la temperatura de peste 90 de grade, timp de 20 - 30 de secunde, cu desfacerea ADN dublu catenar în două lanțuri complementare matriță, de care se vor atașa apoi primerii. Prin urmare, la sfârșitul acestei etape vor rezulta două lanțuri de ADN monocatenar libere în mediul de reacție.
b. Cuplarea primerilor de ADN simplu catenar
Durează 20 - 40 de secunde, timp în care temperatura este scăzută la 55 - 60 de grade. Rezultă ADN dublu catenar hibrid.
c. Extensia primerilor
ADN polimeraza se va lega de lanțul ADN dublu catenar hibrid citind secvența lanțului de ADN matriță și alungește primerii pe baza regulii complementarității dintre bazele azotate.

Fazele amplificării:
- Amplificare exponențială - dublarea cantității de ADN la sfârșitul fiecărui ciclu de polimerizare
- Leveling off - în momentul în care se consumă reactivii, reacțiile se vor desfășura mai lent
- Platou - epuizarea reactivilor

2. Restriction Fragment Length Polymorphism

Tehnica include fragmentarea unei secvențe de ADN cu ajutorul unei enzime de restricție. Fragmentele rezultate sunt separate în funcție de lungimea lor prin electroforeza pe gel de agar și apoi sunt transferate pe o membrană specială prin procedura Southern Blot. Sunt analizate prin aceeași metodă toate probele provenite de la mamă, prezumtivul tată și copil și comparate în funcție de complementaritatea secvențelor de ADN cu aceeași lungime. Metoda RFLP este considerată standardul de aur pentru genotipare însă este limitată de faptul că ADN-ul probelor care intră în testare trebuie să aibă o calitate excepțională penru a putea fi separat în fragmente. Durata testării este de asemenea foarte mare, variind între 3 săptămâni și 3 luni, în timp ce testarea prin metoda PCR durează între 3 și 9 zile.

Testul de paternitate reprezintă unica metodă de a elimina incertitudinea în ce privește stabilirea tatălui biologic al unui copil, fiind un test genetic cu acuratețe 100% în eliminarea indivizilor care nu corespund statutului de tată biologic și acuratețe 99,9% în determinarea individului cu statut de tată biologic. Rezultatul se eliberează în aproximativ o săptămână de la primirea probelor, însă chiar și în România există laboratoare care lucrează în regim de urgență trimițând rezultatul după 8 ore.